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逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)實(shí)驗(yàn)方法
  • 發(fā)布日期:2018-05-31      瀏覽次數(shù):1743
    • 逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng) (Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction,RT-PCR)的原理是:提取組織或細(xì)胞中的總RNA,以其中的mRNA作為模板,采用Oligo(dT)或隨機(jī)引物利用逆轉(zhuǎn)錄酶反轉(zhuǎn)錄成cDNA。再以cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增,而獲得目的基因或檢測(cè)基因表達(dá)。RT-PCR使RNA檢測(cè)的靈敏性提高了幾個(gè)數(shù)量級(jí),使一些極為微量RNA樣品分析成為可能。該技術(shù)主要用于:分析基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物、獲取目的基因、合成cDNA探針、構(gòu)建RNA轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)。

      一、反轉(zhuǎn)錄酶的選擇

      1. Money 鼠白血病病毒(MMLV)反轉(zhuǎn)錄酶:有強(qiáng)的聚合酶活性,RNA酶H活性相對(duì)較弱。zui適作用溫度為37℃。

      2.禽成髓細(xì)胞瘤病毒(AMV)反轉(zhuǎn)錄酶:有強(qiáng)的聚合酶活性和RNA酶H活性。zui適作用溫度為42℃。

      3.Thermus thermophilus、Thermus flavus等嗜熱微生物的熱穩(wěn)定性反轉(zhuǎn)錄酶:在Mn2+存在下,允許高溫反轉(zhuǎn)錄RNA,以消除RNA模板的二級(jí)結(jié)構(gòu)。

      4.MMLV反轉(zhuǎn)錄酶的RNase H-突變體:商品名為Superscript 和SuperScriptⅡ。此種酶較其它酶能多將更大部分的RNA轉(zhuǎn)換成cDNA,這一特性允許從含二級(jí)結(jié)構(gòu)的、低溫反轉(zhuǎn)錄很困難的mRNA模板合成較長(zhǎng)cDNA。

      二、合成cDNA引物的選擇

      1.   隨機(jī)六聚體引物:當(dāng)特定mRNA由于含有使反轉(zhuǎn)錄酶終止的序列而難于拷貝其全長(zhǎng)序列時(shí),可采用隨機(jī)六聚體引物這一不特異的引物來(lái)拷貝全長(zhǎng)mRNA。用此種方法時(shí),體系中所有RNA分子全部充當(dāng)了cDNA*鏈模板,PCR引物在擴(kuò)增過(guò)程中賦予所需要的特異性。通常用此引物合成的cDNA中96%來(lái)源于rRNA。

      2.   Oligo(dT):是一種對(duì)mRNA特異的方法。因絕大多數(shù)真核細(xì)胞mRNA具有3’端Poly(A+)尾,此引物與其配對(duì),僅mRNA可被轉(zhuǎn)錄。由于Poly(A+)RNA僅占總RNA的1-4%,故此種引物合成的cDNA比隨機(jī)六聚體作為引物和得到的cDNA在數(shù)量和復(fù)雜性方面均要小。

      3.   特異性引物:zui特異的引發(fā)方法是用含目標(biāo)RNA的互補(bǔ)序列的寡核苷酸作為引物,若PCR反應(yīng)用二種特異性引物,*條鏈的合成可由與mRNA 3’端zui靠近的配對(duì)引物起始。用此類(lèi)引物僅產(chǎn)生所需要的cDNA,導(dǎo)致更為特異的PCR擴(kuò)增。

      三、 試劑準(zhǔn)備

      1.RMA提取試劑

      2.*鏈cDNA合成試劑盒

      3.dNTPmix:含dATP、dCTP、dGTP、dTTP各2mM

      4.Taq DNA聚合酶

      四、操作步驟

      1. 總RNA的提?。阂?jiàn)相關(guān)內(nèi)容。

      2. cDNA*鏈的合成:目前試劑公司有多種cDNA*鏈試劑盒出售,其原理基本相同,但操作步驟不一?,F(xiàn)以GIBICOL公司提供的SuperScriptTM Preamplification System  for First Strand cDNA Synthesis 試劑盒為例。

      ① 在0.5ml微量離心管中,加入總RNA 1-5μg,補(bǔ)充適量的DEPC H2O使總體積達(dá)11μl。在管中加10μM Oligo(dT)12-18 1μl,輕輕混勻、離心。

      ② 70℃加熱10min,立即將微量離心管插入冰浴中至少1min。

      然后加入下列試劑的混合物:10×PCR buffer  2μl;25mM MgCl2  2μl;10mM dNTPmix 1μl;0.1M DTT  2μl

      輕輕混勻,離心。42℃孵育2-5min。

      ③ 加入SuperscriptⅡ1μl ,在42℃水浴中孵育50min。

      ④ 于70℃加熱15min以終止反應(yīng)。

      ⑤ 將管插入冰中,加入RNase H 1μl ,37℃孵育20min,降解殘留的RNA。-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

      3.PCR:

      ① 取0.5ml PCR管,依次加入下列試劑:*鏈cDNA   2μl;上游引物(10pM) 2μl;下游引物(10pM) 2μl;dNTP(2mM) 4μl;10×PCR buffer 5μl;Taq 酶(2u/μl) 1μl。

      ② 加入適量的ddH2O,使總體積達(dá)50μl。輕輕混勻,離心。

      ③ 設(shè)定PCR程序。在適當(dāng)?shù)臏囟葏?shù)下擴(kuò)增28-32個(gè)循環(huán)。為了保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠與準(zhǔn)確,可在PCR擴(kuò)增目的基因時(shí),加入一對(duì)內(nèi)參(如G3PD)的特異性引物,同時(shí)擴(kuò)增內(nèi)參DNA,作為對(duì)照。

      ④ 電泳鑒定:行瓊脂糖凝膠電泳,紫外燈下觀察結(jié)果。

      ⑤ 密度掃描、結(jié)果分析:采用凝膠圖像分析系統(tǒng),對(duì)電泳條帶進(jìn)行密度掃描。

      五、注意事項(xiàng)

      1.在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中要防止RNA的降解,保持RNA的完整性。在總RNA的提取過(guò)程中,注意避免mRNA的斷裂。

      2. 為了防止非特異性擴(kuò)增,必須設(shè)陰性對(duì)照。

      3.內(nèi)參的設(shè)定:主要為了用于靶RNA的定量。常用的內(nèi)參有G3PD(甘油醛-3-磷酸脫氫酶)、β-Actin(β-肌動(dòng)蛋白)等。其目的在于避免RNA定量誤差、加樣誤差以及各PCR反應(yīng)體系中擴(kuò)增效率不均一各孔間的溫度差等所造成的誤差。

      4. PCR不能進(jìn)入平臺(tái)期,出現(xiàn)平臺(tái)效應(yīng)與所擴(kuò)增的目的基因的長(zhǎng)度、序列、二級(jí)結(jié)構(gòu)以及目標(biāo)DNA起始的數(shù)量有關(guān)。故對(duì)于每一個(gè)目標(biāo)序列出現(xiàn)平臺(tái)效應(yīng)的循環(huán)數(shù),均應(yīng)通過(guò)單獨(dú)實(shí)驗(yàn)來(lái)確定。

      5. 防止DNA的污染:① 采用DNA酶處理RNA樣品;② 在可能的情況下,將PCR引物置于基因的不同外顯子,以消除基因和mRNA的共線(xiàn)性。

    魏經(jīng)理
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