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1.Science：開發(fā)出一種檢測CRISPR脫靶效應(yīng)的新方法---DISCOVER-Seq
doi:10.1126/science.aav9023; doi:10.1126/science.aax1827

自從CRISPR基因組編輯技術(shù)于2012年誕生以來，已經(jīng)顯示出治療許多難治性疾病的巨大希望。然而，在治療相關(guān)的細(xì)胞類型中鑒定潛在的脫靶效應(yīng)，仍然是將治療方法轉(zhuǎn)移到臨床應(yīng)用的主要障礙。如今，來自美國加州大學(xué)伯克利分校、加州大學(xué)舊金山分校、格拉德斯通研究所和瑞典阿斯利康公司的研究人員開發(fā)出一種可靠的方法來實現(xiàn)這一目標(biāo)。相關(guān)研究結(jié)果發(fā)表在2019年4月19日的Science期刊上，論文標(biāo)題為“Unbiased detection of CRISPR off-targets in vivo using DISCOVER-Seq”。

CRISPR通過在特定位置切割DNA來編輯人的基因組。所面臨的挑戰(zhàn)是確保這種工具不會在其他地方進行切割，即一種被稱為“脫靶效應(yīng)”的DNA損傷，這可能會帶來無法預(yù)料的后果。Wienert博士說，“當(dāng)CRISPR進行切割時，DNA會被破壞。為了生存，細(xì)胞將許多不同的DNA修復(fù)因子募集到基因組中的特定位點上以修復(fù)斷裂并將切割末端連接在一起。如果我們能夠找到這些DNA修復(fù)因子的位置，我們就可以鑒定出被CRISPR切割的位點。”

為了測試這種想法，他們研究了一組不同的DNA修復(fù)因子。發(fā)現(xiàn)其中一種稱為MRE11的DNA修復(fù)因子是DNA切割位點的批響應(yīng)者之一。他們利用MRE11開發(fā)了一種名為DISCOVER-Seq的新技術(shù)，可以識別出CRISPR切割基因組的確切位點。

Corn說，“鑒于我們的方法依賴于細(xì)胞的自然修復(fù)過程來識別切割位點，它是一種侵入性更小、更可靠的方法。我們能夠在誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞、患者細(xì)胞和小鼠中測試我們新開發(fā)的DISCOVER-Seq方法，我們的研究結(jié)果表明這種方法可潛在地用于任何系統(tǒng)，而不僅僅是在實驗室中。”

2.Science：揭示腫瘤抑制基因BAP1失活為何僅促進腫瘤在特定組織中形成
doi:10.1126/science.aav4902

腫瘤抑制基因的喪失導(dǎo)致一小部分癌癥出現(xiàn)在特定組織中。由腫瘤抑制基因發(fā)生突變引起的惡性腫瘤具有不明原因的組織傾向性。比如，一種稱為BAP1的腫瘤抑制基因編碼組蛋白H2A的去泛素化酶，但是生殖細(xì)胞中的BAP1突變主要與葡萄膜黑色素瘤和間皮瘤存在關(guān)聯(lián)。

來自美國基因泰克公司的研究人員在一種BAP1誘導(dǎo)性癌癥小鼠模型中，針對這種組織選擇性如何作用于腫瘤抑制基因BAP1提供了一種解釋。相關(guān)研究結(jié)果發(fā)表在2019年4月19日的Science期刊上，論文標(biāo)題為“Intrinsic apoptosis shapes the tumor spectrum linked to inactivation of the deubiquitinase BAP1”。

研究人員發(fā)現(xiàn)在包括小鼠胚胎干細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、肝細(xì)胞和胰腺細(xì)胞在內(nèi)的大多數(shù)細(xì)胞中，BAP1缺失會導(dǎo)致細(xì)胞凋亡，但是這不會誘導(dǎo)黑素細(xì)胞和間皮細(xì)胞凋亡。但是在形成腫瘤的組織中，即便BAP1不存在，具有抗凋亡作用的基因遭受的調(diào)節(jié)差異也會允許這些組織中的細(xì)胞存活下來。至少對這種腫瘤抑制基因而言，它的失活通常會導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。然而，這種機制在一部分組織中失效了，從而允許這些組織中的細(xì)胞發(fā)生增殖并導(dǎo)致腫瘤產(chǎn)生。

泛素連接酶RNF2通過讓組蛋白H2A發(fā)生單泛素化而使得基因受到沉默。在缺乏BAP1的細(xì)胞中，它通過抑制促存活基因Bcl2和Mcl1的表達(dá)來促進細(xì)胞凋亡。相比之下，黑素細(xì)胞中的BAP1缺失對促存活基因的表達(dá)幾乎沒有影響，但會誘導(dǎo)基因Mitf表達(dá)。

3.Science：我國李亦學(xué)課題組和楊輝課題組揭示胞嘧啶堿基編輯器誘導(dǎo)大量的單位點脫靶突變
doi:10.1126/science.aav九973; doi:10.1126/science.aax1827

基因組編輯在治療由致命性突變引起的遺傳疾病上有很大的潛力。對基因組編輯的脫靶效應(yīng)進行全面分析是驗證這種編輯實用性所必需的?？茖W(xué)家們已開發(fā)出多種方法來檢測全基因組范圍內(nèi)的基因編輯脫靶位點。然而，這些方法并不適用于檢測體內(nèi)的單核苷酸變異（SNV）。

中國科學(xué)院的李亦學(xué)（Yixue Li）課題組、楊輝（Hui Yang）課題組和美國斯坦福大學(xué)的Lars M. Steinmetz課題組開發(fā)出一種稱為GOTI（genome-wide off-target analysis by two-cell embryo injection, 利用雙細(xì)胞胚胎注射進行全基因組脫靶分析）的方法來評估三種經(jīng)常使用的基因編輯工具---CRISPR/Cas9、胞嘧啶堿基編輯器3（BE3, rAPOBEC1-nCas9-UGI）、腺嘌呤堿基編輯器7.10（ABE7.10, TadA-TadA*-nCas9）---誘導(dǎo)的脫靶效應(yīng)。簡言之，這些研究人員將CRISPR/Cas9、BE3或ABE7.10與Cre mRNA一起注射到源自Ai9（CAG-LoxP-Stop-LoxP-tdTomato）小鼠的雙細(xì)胞胚胎的卵裂球中。在胚胎期第14.5天（ED14.5）時，基于tdTomato的表達(dá)，利用熒光活化細(xì)胞分選方法（FACS）對經(jīng)過編輯的卵裂球和未經(jīng)過編輯的卵裂球的后代細(xì)胞進行分選。與此同時，在ED14.5時，整個胚胎也很容易經(jīng)消化后獲得足夠的單細(xì)胞。他們隨后對tdTomato陽性細(xì)胞和tdTomato陰性細(xì)胞單獨地進行全基因組測序（WGS）。以來自相同胚胎的tdTomato陰性樣本作為對照，利用三種算法對來自相同胚胎的tdTomato陽性樣本中的SNV和indel（insertion or deletion, 插入或刪除）進行研究。

這項研究分為了12個組：一個Cre組（Cre-only, 僅注射Cre）、6個具有或不具有單向?qū)NA（sgRNA）的Cas9組（Cas9、Cas9-LacZ、Cas9-Pde6b、Cas9-Tyr-A、Cas9-Tyr-B和Cas9-Tyr-C）、三個具有或不具有sgRNA的BE3組（BE3、BE3-Tyr-C和BE3-Tyr-D）和兩個具有或不具有sgRNA的ABE組（ABE7.10和ABE7.10-Tyr-E）。首先，他們通過桑格測序（Sanger sequencing）在胚胎8細(xì)胞和ED14.5時驗證了他們的方法在胚胎中的在靶效率。為了進一步探究在靶效率和潛在的全基因組脫靶效應(yīng)，他們對來自ED14.5胚胎的46個樣本進行全基因組測序，并證實Cas9、BE3和ABE7.10在tdTomato陽性細(xì)胞中地誘導(dǎo)indel和核苷酸替換。

研究人員在經(jīng)過BE3處理的胚胎中，發(fā)現(xiàn)了平均每個胚胎存在283個SNV，這一水平至少要比在經(jīng)過Cre或Cas9處理的胚胎中觀察到的高出20倍。相反之下，在經(jīng)過ABE7.10處理的胚胎中，平均每個胚胎存在10個SNV，這一頻率接近于自發(fā)性突變率。他們進一步地將在BE3-only組（即僅注射BE3的組）中鑒定出的脫靶位點與在BE3-Tyr-C組或BE3-Tyr-D組中鑒定出的脫靶位點進行了比較，并發(fā)現(xiàn)sgRNA的存在并不誘導(dǎo)顯著高的SNV（P=0.21，Kruskal-Wallis test）。此外，這些變異是在tdTomato陽性細(xì)胞而不是在tdTomato陰性細(xì)胞中特異地鑒定出的。

在經(jīng)過BE3編輯的細(xì)胞中鑒定出的90%以上的SNV是G>A或C>T，這一突變偏好并沒有在經(jīng)過Cre、Cas9或ABE7.10處理的細(xì)胞中觀察到。這一突變偏好與APOBEC1本身的突變偏好相同，這表明這些突變并不是自發(fā)的而是由BE3編輯誘導(dǎo)的。之前的研究已表明APOBEC家族的幾個成員（包括APOBEC1）發(fā)揮作用需要單鏈DNA。與此相一致的是，研究人員的分析表明由BE3誘導(dǎo)的SNV在轉(zhuǎn)錄區(qū)域中顯著富集，特別是在高度表達(dá)的基因中。有趣的是，這些脫靶位點中的任何一個并不與經(jīng)過BE3處理的胚胎中觀察到的相同，而且也不與預(yù)測的脫靶突變發(fā)生重疊。此外，也并未在脫靶序列和靶序列之間觀察到相似性，然而，預(yù)測的排名靠前的脫靶位點與BE3的在靶位點存在著較高的序列相似性。因此，BE3引起的脫靶SNV并不依賴于sgRNA并且可能是由APOBEC1過度表達(dá)導(dǎo)致的。

在經(jīng)過BE3處理的胚胎中觀察到的1698個SNV中，26個SNV位于外顯子中，其中的14個導(dǎo)致非同義變化。這些研究人員成功地將通過PCR擴增了其中的20個SNV并通過桑格測序證實了它們的存在。他們還發(fā)現(xiàn)1個SNV位于一個原癌基因中，13個SNV位于腫瘤抑制基因中，這就讓人對BE3編輯的致癌風(fēng)險感到擔(dān)憂。這種風(fēng)險可能通過表達(dá)較低數(shù)量的BE3加以降低。然而，他們發(fā)現(xiàn)當(dāng)表達(dá)較低數(shù)量的BE3時，在靶效率逐漸降低。

令人關(guān)注的是，研究發(fā)現(xiàn)大量新生突變是由BE3誘導(dǎo)的，這一點在之前的研究中并未報道過。一種可能的解釋是GOTI研究了源自單個經(jīng)過基因編輯的卵裂球的細(xì)胞群體，而之前的研究使用了大量的細(xì)胞群體，在那里，編輯是可變的，而且由于細(xì)胞群體平均化，這會導(dǎo)致隨機的脫靶信號丟失。不同于BE3的是，ABE7.10并不導(dǎo)致SNV數(shù)量增加，這很可能是缺乏TadA的DNA結(jié)合能力。這些堿基編輯器的脫靶效應(yīng)可能通過降低APOBEC1的DNA結(jié)合能力或者使用不同的胞苷脫氨酶版本來加以降低。總之，GOTI可用于研究多種基因編輯工具的脫靶效應(yīng)，而且不受在不同個體中存在的單核苷酸多態(tài)性（SNP）的干擾。

4.Science：中科院高彩霞課題組發(fā)現(xiàn)胞嘧啶堿基編輯器引發(fā)意想不到的全基因組脫靶突變
doi:10.1126/science.aaw7166;doi:10.1126/science.aax1827

中國科學(xué)院的高彩霞（Caixia Gao）課題組通過對作為一種重要的作物物種的水稻進行全基因組測序?qū)Π奏A基編輯器（BE3和HF1-BE3）和腺嘌呤堿基編輯器（ABE）產(chǎn)生的脫靶突變進行全面調(diào)查。他們發(fā)現(xiàn)胞嘧啶堿基編輯器（BE3和HF1-BE3）誘導(dǎo)全基因組脫靶突變。相關(guān)研究結(jié)果于2019年2月28日在線發(fā)表在Science期刊上，論文標(biāo)題為“Cytosine, but not adenine, base editors induce genome-wide off-target mutations in rice”。

在這項研究中，高彩霞課題組選擇了三種廣泛使用的堿基編輯器：BE3、高保真BE3（HF1-BE3）和ABE，其中BE3和HF1-BE3屬于胞嘧啶堿基編輯器（CBE）。將靶向11個基因組位點的總共14個堿基編輯器構(gòu)造體通過農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化方法轉(zhuǎn)化到水稻中。他們利用全基因組測序?qū)τ葿E3、HF1-BE3或ABE編輯的再生T0水稻植物；經(jīng)過這些堿基編輯器轉(zhuǎn)化但沒有經(jīng)過sgRNA轉(zhuǎn)化的水稻植物以及兩個對照組水稻植物（即野生型水稻和轉(zhuǎn)基因水稻的無效分離株）進行分析。

這些堿基編輯器組（即BE3組、HF1-BE3組和ABE組）和對照組在發(fā)現(xiàn)的插入或刪除（insertion or deletion, indel）數(shù)量上沒有顯著差異。相反之下，BE3組和HF1-BE3組要比ABE組和對照組具有顯著更多的單核苷酸變異（SNV）。

在堿基編輯器組和對照組中，每株水稻植物的C>T單核苷酸變異（SNV）的平均數(shù)量為：203（BE3）、347（HF1-BE3）、88（ABE）和105（對照組）。因此，BE3組和HF1-BE3組水稻植物中的C>T單核苷酸變異數(shù)量分別比對照組水稻植物高94.5％和231.9％。

由高彩霞課題組產(chǎn)生的數(shù)據(jù)表明是BE3和HF1-BE3，而并不是ABE，在水稻中誘導(dǎo)全基因組脫靶突變。這些脫靶突變主要是C>T單核苷酸變異，在轉(zhuǎn)錄的基因區(qū)域中富集，通過當(dāng)前的計算機方法是無法預(yù)測的。含有胞嘧啶脫氨酶的堿基轉(zhuǎn)化單元可能是由BE3和HF1-BE3引發(fā)的較高數(shù)量的脫靶單核苷酸變異的原因，因而需要加以優(yōu)化以提高胞嘧啶堿基編輯器（BE3和HF1-BE3）的特異性。

5.Science：揭示數(shù)千個神經(jīng)元在口渴-解渴周期中變得活躍
doi:10.1126/science.aav3932; doi:10.1126/science.aax1512

來自美國斯坦福大學(xué)和霍華德休斯醫(yī)學(xué)研究所的研究人員利用一種新工具記錄了小鼠大腦中因口渴和解渴引起的數(shù)千個神經(jīng)元激活。相關(guān)研究結(jié)果于2019年4月4日在線發(fā)表在Science期刊上，論文標(biāo)題為“Thirst regulates motivated behavior through modulation of brainwide neural population dynamics”。在這篇論文中，他們描述了在口渴-解渴周期中對小鼠大腦的研究以及獲得的發(fā)現(xiàn)。

口渴是嚴(yán)肅的事情---如果沒有攝入水，人體就不能堅持很久。這是一項非常重要的活動，研究人員猜測大腦的許多部分可能通過產(chǎn)生口渴的感覺和對液體的攝入作出反應(yīng)來觸發(fā)對水的渴望。為了確定是否確實如此，他們使用一種新工具來研究經(jīng)歷口渴-解渴周期（thirst and quenching cycle）的小鼠。

這種新設(shè)備被稱為Neuropixel探頭，它允許人們一次性記錄數(shù)千個神經(jīng)元的神經(jīng)活動---這種設(shè)備有一個非常細(xì)的可以微創(chuàng)方式直接插入大腦中的軸。通過這種新工具，研究人員能夠記錄23881個神經(jīng)元在87次實驗中放電，覆蓋了21只小鼠的34個大腦區(qū)域。

研究人員設(shè)定的目標(biāo)是記錄在口渴-解渴周期中大腦不同部位的神經(jīng)元放電，這是為了了解大腦在這個關(guān)鍵過程中如何發(fā)揮作用。他們能夠通過監(jiān)測鈉水平和血液滲透壓來檢測小鼠的口渴，而且他們指出，大腦也使用穹窿下器官（subfornical organ）上的細(xì)胞進行這樣的監(jiān)測。當(dāng)鈉水平和血液滲透壓較低時，這些細(xì)胞向大腦的其他部分發(fā)送信號以便觸發(fā)口渴感。
（生物谷）

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