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細(xì)胞培養(yǎng)常見問題
1.如何選擇培養(yǎng)基？
培養(yǎng)某一類型細(xì)胞沒有固定的培養(yǎng)條件。在MEM 中培養(yǎng)的細(xì)胞，很可能在DMEM 或M199 中同樣很容易生長?？傊?，MEM 做粘附細(xì)胞培養(yǎng)、RPMI-1640 做懸浮細(xì)胞培養(yǎng)，各種目的無血清培養(yǎng)的是AIMV 培養(yǎng)基（SFM）。
2.為什么要熱滅活血清？
加熱可以滅活補體系統(tǒng)。激活的補體參與溶解細(xì)胞事件，刺激平滑肌收縮，細(xì)胞和血小板釋放組胺，激活淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞。在進(jìn)行免疫學(xué)研究、培養(yǎng)ES 細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞時，推薦使用熱滅活血清。
3.L-谷氨酰胺在細(xì)胞培養(yǎng)中重要嗎？它在溶液中不穩(wěn)定嗎？
L-谷氨酰胺在細(xì)胞培養(yǎng)時是重要的。脫掉氨基后，L-谷氨酰胺可作為培養(yǎng)細(xì)胞的能量來源、參與蛋白質(zhì)的合成和核酸代謝。L-谷氨酰胺在溶液中經(jīng)過一段時間后會降解，但是確切的降解率一直沒有zui終確定。L-谷氨酰胺的降解導(dǎo)致氨的形成，而氨對于一些細(xì)胞具有毒性。
4.GlutaMAX-I 是什么？培養(yǎng)細(xì)胞如何利用GlutaMAX-I？這個二肽有多穩(wěn)定？
GlutaMAX-I 二肽是L-谷氨酰胺的衍生物，將其不穩(wěn)定的α-氨基用L-丙氨酸來保護(hù)。一種肽酶逐漸裂解二肽，釋放L-谷氨酰胺供利用。GlutaMAX-I 二肽非常穩(wěn)定，即使在121 磅滅菌20 分鐘，GlutaMAX-I 二肽溶液有zui小的降解，如果在相同條件下，L-谷氨酰胺幾乎*降解。
5.為什么培養(yǎng)基中可以省去加酚紅？
酚紅在培養(yǎng)基中被用來作為PH 值的指示劑：中性時為紅色，酸性時為黃色，堿性時為紫色。研究表明，酚紅可以模擬固醇類激素的作用（特別是雌激素）。為避免固醇類反應(yīng)，培養(yǎng)細(xì)胞，尤其是哺乳類細(xì)胞時，用不加酚紅的培養(yǎng)基。由于酚紅干擾檢測，一些研究人員在做流式細(xì)胞檢測時，不使用加有酚紅的培養(yǎng)基。
6.如何用臺盼蘭計數(shù)活細(xì)胞？
用無血清培養(yǎng)基把細(xì)胞懸液稀釋到200-2000 個/毫升，在0.1 毫升的細(xì)胞中加入0.1 毫升的0.4％的臺盼蘭溶液。輕輕混勻，數(shù)分鐘后，用血球計數(shù)板計數(shù)細(xì)胞。活細(xì)胞排斥臺盼蘭，因而染成藍(lán)色的細(xì)胞是死細(xì)胞。
7.如何消除組織培養(yǎng)的污染？
當(dāng)重要的培養(yǎng)污染時，研究者可能試圖消除或控制污染。首先，確定污染物是細(xì)菌、真菌、支原體或酵母，把污染細(xì)胞與其它細(xì)胞系隔離開，用實驗室消毒劑消毒培養(yǎng)器皿和超凈臺，檢查HEPA 過濾器。 高濃度的抗生素和抗霉菌素可能對一些細(xì)胞系有毒性，因而，做劑量反應(yīng)實驗確定抗生素和抗霉菌素產(chǎn)生毒性的劑量水平。這點在使用抗生素如兩性霉素B 和抗霉菌素如泰樂菌素時尤其重要。下面是推薦的確定毒性水平和消除培養(yǎng)污染的實驗步驟。
1)在無抗生素的培養(yǎng)基中消化、計數(shù)和稀釋細(xì)胞，稀釋到常規(guī)細(xì)胞傳代的濃度。
2)分散細(xì)胞懸液到多孔培養(yǎng)板中，或幾個小培養(yǎng)瓶中。在一個濃度梯度范圍內(nèi)，把選擇抗生素加入到每一個孔中。例如，兩性霉素B 推薦下列濃度，0.25，0.50，1.0，2.0，4.0,8.0 mg/ml。
3)每天觀測細(xì)胞毒性指標(biāo)，如脫落，出現(xiàn)空泡，匯合度下降和變圓。
4)確定抗生素毒性水平后，使用低于毒性濃度2-3 倍濃度的抗生素的培養(yǎng)液培養(yǎng)細(xì)胞2-3 代。
5)在無抗生素的培養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)胞一代。
6)重復(fù)步驟4。
7)在無抗生素的培養(yǎng)基中培養(yǎng)4-6 代，確定污染是否以已被消除。
8.培養(yǎng)基中丙酮酸鈉的作用是什么？
丙酮酸鈉可以作為細(xì)胞培養(yǎng)中的替代碳源。盡管細(xì)胞更傾向于以葡萄糖作為碳源，但是，如果沒有葡萄糖的話，細(xì)胞也可以代謝丙酮酸鈉。
9.Hank’s 平衡鹽溶液（HBS）要在空氣中使用，不需要CO2 培養(yǎng)箱。原因是什么？Hank’s平衡鹽溶液（HBS）和Earle’s 平衡鹽溶液（EBS）有什么本質(zhì)的功能差別？
HBS 和 EBS 的主要差別在于碳酸氫鈉的水平，碳酸氫鈉的含量在Eagles (2.2g/L)中比在Hanks (0.35g/L)中高。碳酸氫鈉需用高水平的CO2 平衡，以維持溶液的PH 值。Eagles 液在空氣水平的CO2 中，溶液會變堿，Hanks 液在CO2 培養(yǎng)箱中會變酸。如果希望在CO2 培養(yǎng)箱中保存組織，需要用Eagles 液。如果僅僅是清洗將要在細(xì)胞培養(yǎng)基中儲存的組織，用Hanks 液就可以了。
10.Qualified 和 Certified 胎牛血清有什么差別?
Certified 胎牛血清包括了Qualified 胎牛血清執(zhí)行的所有的標(biāo)準(zhǔn)檢驗程序，而且除了這些標(biāo)準(zhǔn)檢測，Certified 胎牛血清還有如下一些附加的檢測：End-Point Determination of Endotoxin Content
噬菌體檢驗
生物化學(xué)檢測
激素的檢測
血紅蛋白檢測
Sf9 細(xì)胞生長促進(jìn)及方法學(xué)檢測
11.二價離子抑制胰蛋白酶活性嗎？使用胰蛋白酶時加入EDTA 的目的是什么？
二價離子的確抑制胰蛋白酶活性。EDTA 用來螯合游離的鎂離子和鈣離子，以便保持抑制胰蛋白酶的活性。建議胰蛋白酶處理細(xì)胞前，用EDTA 清洗細(xì)胞，以消除來自培養(yǎng)基中所有的二價離子。
12.制備 lipid-DNA 的方法會影響轉(zhuǎn)染效率嗎？
是的。對于LIPOFECTAMlNE Reagent，稀釋試劑在100μl OPTI-MEM 中，稀釋DNA 在100μl OPTI-MEM中。混合兩種溶液在室溫下孵育15 分鐘。對于LIPOFECTIN Reagent，在加入DNA 溶液前允許稀釋的試劑和培養(yǎng)基孵育至少30 分鐘可以增加3 倍的效率。確保復(fù)合物在沒有血清的情況下形成。孵育15 分鐘后，在復(fù)合物中加入含有血清的培養(yǎng)基（800μl）。（注意以上是35mm 培養(yǎng)皿使用體積）。對于LIPOFECTAMlNE Plus Reagent DNA 應(yīng)該在與脂質(zhì)體混合之前首先與Plus Reagent 混合。LIPOFECTAMlNE 2000 的操作步驟允許在一個很小的體積下混合DNA 和脂質(zhì)體，接下來可以不需要換培養(yǎng)基的情況下直接加入。
13.我使用SF900 Ⅱ時，細(xì)胞生長良好，但是為什么我的蛋白產(chǎn)物不如使用Graces 液和10%胎牛血清時效果好？
如果目的蛋白是一個后期蛋白，它將與蛋白酶一起表達(dá)，這些蛋白酶將會作用于目的蛋白。在加有血清的培養(yǎng)基中，這些蛋白酶將作用到血清中的蛋白，從而使目的蛋白產(chǎn)品保持完好。在無血清配方中，蛋白酶作用的*底物是你的目的蛋白。為了避免這一問題，加入一些蛋白酶抑制劑或加入少量的血清（少于1％），讓血清給蛋白酶提供作用底物。
14.如何檢測內(nèi)毒素(熱源)水平？
LAL（Limulus Amebocyte Lysate）試驗是可用的zui敏感和特異的檢測細(xì)菌內(nèi)毒素的方法。Levin 和Bang 發(fā)現(xiàn)細(xì)菌可引起鱟（Limulus polyphemus）血管內(nèi)的凝集作用。內(nèi)毒素啟動一個細(xì)胞內(nèi)酶原系統(tǒng)（絲氨酸蛋白酶級聯(lián)反應(yīng)系統(tǒng)），通過修飾凝集素，產(chǎn)生一種透明的膠，LAL 中的凝固蛋白，從而，形成不可溶的基質(zhì)。LAL 試劑緩沖的鱟（血細(xì)胞）裂解物。胎牛血清的內(nèi)毒素檢測是在Grand Island，按照手冊上Gel-clot 方法進(jìn)行的。在對血清產(chǎn)品進(jìn)行內(nèi)毒素檢測前，用無熱源的水1：10 稀釋樣品。稀釋樣品沸水育5 分鐘，以消除抑制劑。（通常，血液中的內(nèi)毒素結(jié)合成份的出現(xiàn)會抑制凝膠過程，使內(nèi)毒素不能與LAL 反應(yīng)。樣品預(yù)先熱處理可以消除這種抑制作用。）
15.我可以使用固體形式的Murashige Skog 培養(yǎng)基嗎？
如果使用固體形式的培養(yǎng)基，需要加入瓊脂。瓊脂加入前要先滅菌。應(yīng)該避免MS 培養(yǎng)基的直接滅菌，應(yīng)該高壓滅菌瓊脂溶液，然后把融化的瓊脂溶液加入到MS 培養(yǎng)基中。
16. 20℃下配制的緩沖液，在較高或較低的溫度下PH 值會改變嗎？
對于普通使用的緩沖液，PH 值隨溫度變化而變化。
下表列出溫度改變10℃時，PH 值的變化情況
例如 20℃下配制PH7.4 Tris 緩沖液,40℃時PH 值為 7.4-（2x0.310）＝6.78
17. 室溫下(25℃)配制的Tris-HCl 溶液，在37℃使用時PH 值是多少？
緩沖液的PH 值隨溫度變化而變化。下表列出了50mM Tris-HC 溶液在4℃，25℃，37℃時，不同的PH值。
4°C 25°C 37°C
8.1 7.5 7.2
8.2 7.6 7.3
8.3 7.7 7.4
8.4 7.8 7.5
8.5 7.9 7.6
8.6 8.0 7.7
8.7 8.1 7.8
8.8 8.2 7.9
8.9 8.3 8.0
9.0 8.4 8.1
9.1 8.5 8.2
9.2 8.6 8.3
9.3 8.7 8.4
9.4 8.8 8.5
18. 昆蟲細(xì)胞培養(yǎng)的zui適PH 值和滲透壓是多少？
生長培養(yǎng)基的PH值對細(xì)胞的增值和病毒或重組蛋白的生產(chǎn)均會產(chǎn)生影響。對于大部分鱗翅類昆蟲細(xì)胞系，在PH 值 6.0-6.4 范圍的大部分應(yīng)用效果良好。培養(yǎng)鱗翅類昆蟲細(xì)胞系時，培養(yǎng)基的zui適滲透壓是345-380mOsm/kg.。為保證可靠和持久的細(xì)胞培養(yǎng)方式，減少技術(shù)問題，保持PH 值和滲透壓在以上所列的范圍之內(nèi)。
19. High Five 細(xì)胞有任何其它名稱嗎？
High Five 細(xì)胞也被稱為Trichoplasia ni 5B1-4 和BTI-TN-5B1-4。
20.在High Five 無血清培養(yǎng)基中去污劑的濃度是多少？
High Five 無血清培養(yǎng)基中去污劑的濃度：0.025 g/L Tween-80，1.0 g/L Pluronic Poly-all。
21.High Five 細(xì)胞用多大的密度凍存？
3.0x10E6 cells/ml
22.在我的果蠅培養(yǎng)基中發(fā)現(xiàn)形成白色沉淀，加熱后溶解。它是什么？對我的細(xì)胞有害嗎？
可能是谷氨酰胺沉淀，但是更可能是L-酪氨酸沉淀。培養(yǎng)基中谷氨酰胺的濃度比典型的2mM 高6 倍。酪氨酸的濃度比在RPMI 1640 中高25 倍，而且比谷氨酰胺更加難以溶解。沉淀也可能是不止一種成分的復(fù)合物。它可能是由于貯存在局部溫度較低的地方引起。只要沉淀在培養(yǎng)條件下可以溶解，對實驗不會有不利的影響。
23.如何從T25 瓶中轉(zhuǎn)移sf9 細(xì)胞？能用胰蛋白酶消化嗎？
我們強力推薦使用脫落細(xì)胞的方法，因為這項技術(shù)破壞性zui小，生活力zui高。通過使用巴氏德吸液管，讓細(xì)胞上培養(yǎng)基流動。作為一種選擇你也可以輕輕拍打培養(yǎng)瓶。只有在必要的情況下，才使用胰酶消化細(xì)胞。
胰酶消化一個T25 瓶的sf9 細(xì)胞：
1)去除培養(yǎng)基。
2) 用2ml 1xPBS（足以覆蓋細(xì)胞表面）洗滌細(xì)胞，去除PBS.
3) 加入2ml 1x 胰酶EDTA（恰好覆蓋細(xì)胞表面）。
4) 37 ℃孵育5 到10 分鐘。在儀器下檢測看到5 分鐘后它們正在向上移動。
5) 向細(xì)胞中加入2ml 細(xì)胞培養(yǎng)液，移入錐形管，用2ml 培養(yǎng)液洗瓶壁，移入同一錐形管中。（培養(yǎng)基中的FBS 終止了胰酶的活性。）
6) 離心（1100rpm）沉淀細(xì)胞。去除培養(yǎng)基。
7) 用新的培養(yǎng)基重新懸浮細(xì)胞。傳代。
24.在Sf9, Sf21, 和high Five 細(xì)胞懸浮培養(yǎng)時，肝素的使用量是多少？
為了防止懸浮培養(yǎng)細(xì)胞聚集的形成，使用肝素濃度為10 單位/毫升細(xì)胞懸液。
25.如何評估ES 細(xì)胞合格的胎牛血清？
使用D3 ES 細(xì)胞。這是一個對于胎牛血清中生長促進(jìn)、生長抑制和分化因子非常敏感的細(xì)胞系。 相關(guān)生長效率分析：當(dāng)ES 細(xì)胞以非常低的密度傳入包含10％胎牛血清的生長培養(yǎng)基中，檢測開始和支持ES 細(xì)胞克隆的能力。
細(xì)胞毒分析：
當(dāng)以非常低的密度傳入包含30％胎牛血清的生長培養(yǎng)基中，檢測ES 細(xì)胞和feeder 細(xì)胞的生長能力。
相關(guān)形態(tài)學(xué)和分化分析：
檢測胎牛血清支持未分化ES 細(xì)胞克隆的能力。通過堿性磷酸酶活性評估分化程度。未分化的ES 細(xì)胞小顏色深紅粉紅，分化的細(xì)胞較大，豐滿，顏色較淺。所有的分析在沒有ESGRO 的情況下進(jìn)行的，培養(yǎng)基中出現(xiàn)ESGRO 會掩蓋由胎牛血清所導(dǎo)致的問題。
（ESGRO 或LIF 經(jīng)常用來保持ES 細(xì)胞處于未分化狀態(tài)。）
經(jīng)過培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)，大約8 批中有1 批可以用來培養(yǎng)ES 細(xì)胞。
26.在重新凍存sf9 細(xì)胞前，它可以傳多少代？隨著傳代的次數(shù)的增加，它的感染能力會降低嗎？
通常情況當(dāng)細(xì)胞經(jīng)過30 次傳代后，應(yīng)該返回凍存。無論什么時候記數(shù)時，都應(yīng)該檢查細(xì)胞活力。如果超過95％的細(xì)胞保持有活力和在大約30 小時左右加倍，細(xì)胞仍然可以使用。如果活力和加倍時間下降，它們的感染力將不在是有效的。
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