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磁微?;瘜W(xué)發(fā)光免疫分析
  • 發(fā)布日期:2017-12-19      瀏覽次數(shù):2594
    • 免疫學(xué)的發(fā)展史起始于微生物學(xué)研究,于18世紀(jì)建立,19 世紀(jì)至 20 世紀(jì)中期進(jìn)入經(jīng)典發(fā)展期。這一時期,人們對免疫功能的認(rèn)識由人體現(xiàn)象的觀察進(jìn)入了科學(xué)實驗時期。20世紀(jì)初期到中期,進(jìn)入近代免疫學(xué)時期。從20世紀(jì)中期開始,真正進(jìn)入現(xiàn)代免疫學(xué)時期?,F(xiàn)代免疫學(xué)的檢測基本歷經(jīng)了以下幾個過程,如圖1所示。

      圖1.免疫檢測技術(shù)的發(fā)展史

      免疫學(xué)檢測主要是利用抗原和抗體的特異性反應(yīng)進(jìn)行檢測,利用同位素、酶、化學(xué)發(fā)光物質(zhì)等對檢測信號進(jìn)行放大和顯示,常被用于檢測蛋白質(zhì)、激素等微量物質(zhì)。各類免疫學(xué)檢測方法的性質(zhì)及發(fā)展?fàn)顩r詳見表格1。免疫診斷在臨床診斷中占據(jù)著非常重要的地位,但是從我國臨床免疫診斷現(xiàn)狀來看,其步伐都落后于發(fā)達(dá)國家,亟待改進(jìn)。

       放射性免疫酶聯(lián)免疫化學(xué)發(fā)光電化學(xué)發(fā)光納米磁微?;瘜W(xué)發(fā)光
      檢測靈敏度10-1510-1310-15- 10-1810-1710-21
      精密度(批間差)>15%10%-15%<10%-15%5%<10%
      線性范圍105102106-7107107
      檢測時間3-4小時2-3小時65分鐘10分鐘18-40分鐘
      放射污染
      操作手工手工/批量自動化手工/全自動全自動全自動
      有效期2個月6-12個月12個月12個月12個月
      定性/定量定量定性/半定量定量定量定量
      發(fā)展趨勢環(huán)境污染,國內(nèi)處于衰退期;歐美已經(jīng)*淘汰。國內(nèi)處于成熟期;歐美處于衰退期。國內(nèi)處于導(dǎo)入期和成長期;歐美處于成熟期。可使用項目廣泛,羅氏技術(shù)。各項目可隨機(jī)組合使用,國內(nèi)處于發(fā)展期。

      表1. 各類免疫檢測技術(shù)的性質(zhì)及優(yōu)缺點

      化學(xué)發(fā)光技術(shù)是近二、三十年來發(fā)展起來的一種測定方式。該技術(shù)的原理是利用化學(xué)反應(yīng)釋放的自由能激發(fā)中間體(常用堿性磷酸酶-金剛烷胺、辣根過氧化酶-魯米諾衍生物、辣根過氧化酶-魯米諾衍生物),使其從激發(fā)態(tài)回到基態(tài)。當(dāng)中間體從激發(fā)態(tài)回到基態(tài)時會釋放等能級的光子,對光子進(jìn)行測定而進(jìn)行定量分析(見圖2)?;瘜W(xué)發(fā)光具有熒光的特異性,同時不需要激發(fā)光,避免了熒光分析中激發(fā)光雜散光的影響從而提高了靈敏度,并且避免了放射分析造成的環(huán)境污染和健康危害,是一種非常的定量分析方法。

       

      圖2. 化學(xué)發(fā)光基本原理示意圖

      化學(xué)發(fā)光免疫分析(CLIA)是一種高度敏感的微量測定技術(shù),凡具有抗原性的物質(zhì)(包括半抗原)都可以用CLIA測定。CLIA起步于80年代初,快速發(fā)展于90年代具備以下特點 :
      ①高度敏感,極限達(dá)10-17-10-19mol/L,遠(yuǎn)高于放射性免疫(RIA)、酶聯(lián)免疫(EIA)。與時間分辨熒光免疫分析(TRFIA)相當(dāng),但比TRFIA便宜。
      ②特異性強(qiáng),重復(fù)性好CV<10%。
      ③測定范圍寬,可達(dá)7個數(shù)量級。
      ④試劑穩(wěn)定性好,無污染有效期12月。
      ⑤操作簡單,易于自動化。
      磁微?;瘜W(xué)發(fā)光免疫分析是將磁性分離技術(shù)、化學(xué)發(fā)光技術(shù)、免疫分析技術(shù)三者結(jié)合起來的一種新興分析方法,其基本原理見圖3 。該技術(shù)充分利用了磁性分離技術(shù)的快速易自動化性,化學(xué)發(fā)光技術(shù)的高靈敏度性,以及免疫分析的特異性,在生物分析領(lǐng)域展現(xiàn)了不可替代的作用。

      圖3. 磁微?;瘜W(xué)發(fā)光免疫檢測(雙抗夾心法)原理示意圖

      目前磁微粒化學(xué)分析免疫分析已經(jīng)應(yīng)用于管式化學(xué)發(fā)光免疫檢測項目以及電化學(xué)發(fā)光免疫檢測項目。

       

      能夠用于化學(xué)發(fā)光免疫分析的磁珠種類

      按材質(zhì)分:

      材質(zhì)優(yōu)點缺點
      磁性瓊脂糖微球1. 親水性強(qiáng),溫和的條件容易洗脫,不至于引起酶失活或蛋白質(zhì)變性
      2. 表面惰性,非特異性吸附低,受pH影響小
      3. 容量大,具有開放性的支撐骨架
      4. 組織相容性好
      1. 機(jī)械性能和力學(xué)性能較差
      2. 溶脹程度會隨溶劑性質(zhì)變化
      磁性二氧化硅微球1. 機(jī)械強(qiáng)度相對較強(qiáng)
      2. 化學(xué)穩(wěn)定性較優(yōu)
      1. 硅膠自身結(jié)構(gòu)空隙較多,容易造成表面大量的水存積,增加了化學(xué)反應(yīng)的復(fù)雜性
      2. 堿性條件下非常不穩(wěn)定
      3. 存在較大的非特異性吸附性
      磁性聚丙烯酰胺/聚丙烯酸類高分子微球1. 具有較好的親水性
      2. 良好的血液相容性
      3. 與其他高分子化合物共聚,改善其力學(xué)性能和穩(wěn)定性
      收縮過大,易產(chǎn)生縮孔
      磁性聚苯乙烯微球1. 機(jī)械強(qiáng)度高
      2. 表面易功能化
      3. 表面非離子相互作用弱
      4. 交聯(lián)聚苯乙烯能夠在強(qiáng)酸強(qiáng)堿中保持穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)
      5. 微球粒徑大小可控
      聚苯乙烯微球表面為疏水性,對某些蛋白存在非特異性,需要對表面進(jìn)行功能化修飾

      按照官能團(tuán)分:

      磁珠種類常見活化方法配體的反應(yīng)位點
      羥基磁珠CDI活化、溴化氰氨基
      羧基磁珠EDC活化,NHS活化氨基
      氨基磁珠戊二醛活化氨基
      環(huán)氧基磁珠——巰基、氨基
      NHS磁珠——氨基
      SA磁珠配體生物素標(biāo)記生物素

       

      海貍磁珠應(yīng)用于化學(xué)發(fā)光免疫檢測機(jī)理

       

      免疫吸附種類原理舉例
      磁性微球表面固定抗原將抗原固定在微球表面,吸附相應(yīng)的抗體和殘留有抗體活性的免疫復(fù)合物Mag COOH(70102) Mag NHS(70701)
      磁性微球表面固定抗體將抗體固定在微球表面,吸附相應(yīng)的抗原和殘留有抗原活性的免疫復(fù)合物Mag COOH(70102) Mag NHS(70701)
      磁性微球表面固定補體利用補體Clq與免疫復(fù)合物的Fc段結(jié)合吸附免疫復(fù)合物,如DNA-抗DNA抗體復(fù)合物_
      磁性微球表面固定蛋白A/G/L蛋白A/G/L固定在磁性微球表面,可吸附抗體和免疫復(fù)合物Mag protein A (22203) Magrsoe ProteinA/G(22202)
      疏水結(jié)合型磁珠表面為疏水性材質(zhì),能夠與目標(biāo)生物分子疏水作用力結(jié)合磁珠表面具有疏水性配體,能夠與目標(biāo)生物分子共價作用力結(jié)合對甲苯磺酰基磁珠+疏水蛋白 聚苯乙烯微球+磷酯類蛋白
      靜電結(jié)合型配體與被吸附物靠靜電作用而結(jié)合。磁性微球表面為帶陰離子基團(tuán)的甲基白蛋白,可靜電結(jié)合帶陽離子基團(tuán)的DNA-抗DNA抗體復(fù)合物

       

      磁珠用于化學(xué)發(fā)光領(lǐng)域的方法

      間接法

      間接法就是包被抗原,然后用酶標(biāo)記的抗抗體檢測樣本中抗體,基本原理見圖4,適合于檢測對象是自身抗體的情況。間接法的優(yōu)點:相對較方便,只要變換包被抗原就可以檢測不同的項目。間接法的缺點:標(biāo)本中的特異性抗體會競爭性的結(jié)合抗原,使結(jié)果出現(xiàn)假陰性。

      圖4. 采用間接法進(jìn)行化學(xué)發(fā)光檢測基本原理

      操作步驟:

      a)磁性微球表面固定抗原。
      b)加入樣本(含目標(biāo)抗體)孵育,清洗。
      c)加入酶標(biāo)抗抗體孵育,清洗。
      d)加發(fā)光底物,檢測信號。

      捕獲法

      血清中針對某些抗原的特異性IgM常和特異性IgG同時存在,后者會干擾IgM抗體的測定,因此測定IgM抗體多用捕獲法。基本原理如圖5所示,先將所有血清IgM(包括異性IgM和非特異性IgM)固定在固相上,去除IgG后測定特異性IgM。

      圖5. 采用捕獲法進(jìn)行化學(xué)發(fā)光檢測基本原理

      操作步驟:

      a)將抗人IgM抗體連接在固相載體上形成固相抗人IgM,洗滌。
      b)加入稀釋的血清標(biāo)本中的IgM抗體被固相抗體捕獲洗滌除去其他免疫球蛋白和血清中的雜質(zhì)成分。
      c)加入特異性抗原試劑:它只與固相上的特異性IgM結(jié)合洗滌。
      d)加入針對特異性的酶標(biāo)抗體:使之與結(jié)合在固相上的抗原反應(yīng)結(jié)合洗滌。
      e)加底物顯色,檢測信號。

      固相抗原競爭法

      競爭法,是指受檢抗體和酶標(biāo)抗體競爭性的與磁珠表面抗原結(jié)合。固相抗原競爭法基本原理如圖6所示。結(jié)合于固相載體的酶標(biāo)抗體與受檢抗體的量呈反比。若受檢樣本中無抗體,酶標(biāo)抗體能夠順利與抗原結(jié)合,出現(xiàn)強(qiáng)信號。若受檢樣本中有抗體,則競爭性的占去了酶標(biāo)抗體與抗原的結(jié)合,酶標(biāo)抗體的結(jié)合力減弱,信號強(qiáng)度減弱。

      圖6. 采用固相抗原競爭法進(jìn)行化學(xué)發(fā)光檢測基本原理

      操作步驟:

      a)磁珠表面固定特異性抗原。
      b)加受檢標(biāo)本和酶標(biāo)抗原的混合液孵育。
      c)加發(fā)光底物,檢測信號。

      雙抗夾心(兩步法)

      雙抗體夾心法是檢測抗原zui常用的方法,基本原理如圖7所示。

      圖7. 采用雙抗夾心法(兩步法)進(jìn)行化學(xué)發(fā)光檢測基本原理

      操作步驟:

      a)將特異性抗體與固相載體連接,形成固相抗體:洗滌除去未結(jié)合的抗體及雜。
      b)加受檢標(biāo)本:使之與固相抗體接觸反應(yīng)一段時問,讓標(biāo)本中的抗原與固相載體上的抗體結(jié)合,形成固相抗原復(fù)合物。洗滌除去其他未結(jié)合的物質(zhì)。
      c)加酶標(biāo)抗體:使固相免疫復(fù)合物上的抗原與酶標(biāo)抗體結(jié)合。*洗滌未結(jié)合的酶標(biāo)抗體。此時固相載體上帶有的酶量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量成正相關(guān)。
      d)加發(fā)光底物:夾心式復(fù)合物中的酶催化底物成為有色產(chǎn)物。根據(jù)顏色反應(yīng)的程度進(jìn)行該抗原的定性或定量。

      雙抗夾心法(一步法)

      在一步法測定中,應(yīng)注意鉤狀效應(yīng)(hook effect),類同于沉淀反應(yīng)中抗原過剩的后帶現(xiàn)象。當(dāng)標(biāo)本中待測抗原濃度相當(dāng)高時,過量抗原分別和固相抗體及酶標(biāo)抗體結(jié)合,而不再形成夾心復(fù)合物,所得結(jié)果將低于實際含量。鉤狀效應(yīng)嚴(yán)重時甚至可出現(xiàn)假陰性結(jié)果(如圖8, 雙抗夾心法及雙位點一步法。缺點:假陰性)

      圖8. 采用雙抗夾心法(一步法)進(jìn)行化學(xué)發(fā)光檢測基本原理

      圖9. 采用雙抗夾心法(一步法)進(jìn)行化學(xué)發(fā)光檢測,當(dāng)樣本中抗原量較多是,容易出現(xiàn)假陰性。

      操作步驟:

      a)磁珠表面固定一抗。
      b)加樣本和酶標(biāo)二抗孵育,清洗。
      c)加發(fā)光底物,檢測信號。

       

      海貍產(chǎn)品優(yōu)勢

      的表面技術(shù)

      蘇州海貍生物醫(yī)學(xué)工程有限公司,掌握先進(jìn)的生物納米表面技術(shù),能夠保證蛋白的覆蓋率、有效控制蛋白質(zhì)的定向包被、充分表露蛋白的活性位點。生物納米表面技術(shù)成功將生物技術(shù)與納米技術(shù)融合,明顯改善一些生物材料表面的非特異性吸附現(xiàn)象。通過近4年的技術(shù)沉淀,已經(jīng)申請相應(yīng)12篇。

      海貍公司生物納米表面技術(shù),能夠保證蛋白的定向性,以及活性位點的充分暴露。
      左圖普通技術(shù)包被的磁珠,表面抗體呈現(xiàn)雜亂無章,保持5%-10%的抗體活性。
      右圖海貍公司采用定向包被技術(shù),保證抗體的活性端充分暴露,保持抗體100%的活性。

      自主研發(fā)磁珠

      作為大、種類zui全的磁珠生產(chǎn)商之一,蘇州海貍生物醫(yī)學(xué)工程有限公司以的生物納米表面技術(shù)和生物試劑技術(shù)為核心,開發(fā)了一系列生物醫(yī)用磁珠及試劑盒。其中,磁珠類產(chǎn)品線囊括了多個領(lǐng)域,包括特異性標(biāo)記與捕獲,蛋白快速分離與純化,核酸提取與文庫構(gòu)建,及高通量、自動化生物樣本處理綜合技術(shù)平臺。目前,海貍公司已經(jīng)發(fā)展成為一家集自主研發(fā)、規(guī)?;a(chǎn)和于一體的生物醫(yī)學(xué)工程領(lǐng)域高科技企業(yè)。

      海貍公司磁珠的微觀形貌

      a)Mag COOH-2000掃描電鏡顯微鏡圖,該磁珠的粒徑分布均一,為2微米。表面光滑,能夠降低部分非特異性吸附。
      b)Mag NH2-500偶聯(lián)SA蛋白后的掃描電鏡顯微鏡圖片。采用海貍納米科技表面技術(shù)包被的SA磁珠能夠保證SA蛋白的均勻包被,且避免磁珠的粘連。
      c)磁性瓊脂糖微球的顯微鏡成像圖片。采用納米級磁核,填充于30-150μm的瓊脂糖微球內(nèi),形成載量*的微球。對抗體的結(jié)合量達(dá)30mg/mL磁性微球。
      d)將Magrose NHS磁珠偶聯(lián)熒光蛋白后,在熒光顯微鏡中成像圖片。該磁珠能夠促使蛋白均勻分布,且保證蛋白的利用效率。

       

      海貍磁珠(BeaverBeads™)在化學(xué)發(fā)光領(lǐng)域的應(yīng)用

      可用于化學(xué)發(fā)光領(lǐng)域的磁珠,種類如前面第三章所列。但其中,鏈霉親和素磁珠的使用,主要是因為親和素-生物素系統(tǒng)的通用型以及廣泛性。親和素-生物素系統(tǒng)(BAS)的主要特點如下列表。

      靈敏度高生物素容易與蛋白質(zhì)和核酸類等生物大分子結(jié)合,并保持大分子物質(zhì)的原有生物活性。
      每個親和素分子有四個生物素結(jié)合部位,可同時以多價形式結(jié)合生物素化的大分子衍生物和標(biāo)記物。
      因此,BAS具有多級放大作用,使其在應(yīng)用時可極大地提高檢測方法的靈敏度。
      穩(wěn)定性好生物素與親和素間的作用是目前已知強(qiáng)度zui高的非共價作用,親和常數(shù)(K)為1015mol/L,比抗原與抗體間的親和力至少高1萬倍。
      二者的結(jié)合穩(wěn)定性好專一性強(qiáng),不受試劑濃度,pH環(huán)境,抑或蛋白變性劑等有機(jī)溶劑影響。
      特異性強(qiáng)親和素與生物素間的結(jié)合具有*的親和力,其反應(yīng)呈高度專一性。而且,BAS結(jié)合特性不會因反應(yīng)試劑的高度稀釋而受影響,使其在實際應(yīng)用中可zui大限度地降低反應(yīng)試劑的非特異作用。
      普適性廣生物素-結(jié)合素系統(tǒng)的多功能性還能提供一套統(tǒng)一的研究方法,適合用于不同的項目體系。
      其他通用性強(qiáng),可制成多種通用性試劑(如生物素化二抗)適用于不同的反應(yīng)體系。
      生物素與親和素的結(jié)合具高速、的特性,盡管BAS的反應(yīng)層次較多,但所需的溫育時間很短。

      海貍鏈霉親和素磁珠,是采用蘇州海貍生物醫(yī)學(xué)工程納米表面技術(shù),將重組鏈霉親和素蛋白高密度定向包被到超順磁性微球表面,排列均勻,并朝向一致。產(chǎn)品具有較高的生物素結(jié)合效率和較低的蛋白及DNA非特異吸附。每mg磁珠的游離生物素結(jié)合量高達(dá)800pmol以上,生物素化抗體結(jié)合量為20μg以上。

      海貍鏈霉親和素磁珠化學(xué)發(fā)光實驗結(jié)果

      在配合全自動化學(xué)發(fā)光儀進(jìn)行檢測時,體現(xiàn)出很好的穩(wěn)定性,以及與進(jìn)口品牌磁珠相當(dāng)?shù)撵`敏性。

      化學(xué)發(fā)光免疫檢測**項目
      Competitor D
       RLU-1RLU-2RLU-3AVECVRatio(S/0)
      S0170261703317804172882.6%/
      S1342033391136506348734.1%2.0
      S2532555340552721531270.7%1.5
      S31836571871461689841799295.4%3.4
      S47916648274817957088049512.4%4.5
      S520581232204629224823021703274.6%2.7
      S637778413635292365117636881032.1%1.7
      BeaverBeadsTMStreptavidin
       RLU-1RLU-2RLU-3AVECVRatio(S/0)
      S095919817977797281.2%/
      S1281322931126109278515.8%2.9
      S2430374237244145431852.1%1.6
      S31793521652821814231753525.0%4.1
      S47647937317047763447576143.1%4.3
      S519675931950715196013519594810.4%2.6
      S633657583348558360566234399934.2%1.8

      檢測方法:雙抗夾心兩步法

      結(jié)論

      BeaverBeadsTMStreptavidin具有很好的穩(wěn)定性能,CV值控制在5%以內(nèi)與進(jìn)口磁珠相當(dāng)。
      BeaverBeadsTMStreptavidin對非特異性具有良好的控制,S0明顯低于進(jìn)口磁珠。
      BeaverBeadsTMStreptavidin的靈敏度較高,Ratio(S/0)比值控制在2.0,與進(jìn)口磁珠相當(dāng)。

    魏經(jīng)理
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